กล้องคอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล (อังกฤษ: Confocal microscope ; Confocal microscopy) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้เทคนิคทางแสงบริเวณจุดโฟกัส (focal point) ในการถ่ายภาพเพื่อเพิ่มความละเอียด (resolution) และความคมชัด (contrast) ของภาพถ่าย โดยใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดและรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงบริเวณนอกจุดโฟกัส^[1] ซึ่งเทคนิคการถ่ายภาพลักษณะนี้สามารถสร้างภาพของโครงสร้างในรูปแบบสามมิติได้ โดยใช้ภาพจากระนาบโฟกัสต่างๆ มาประกอบกัน เทคนิคนี้ได้รับความนิยมในวงการวิทยาศาสตร์และอุตสาหกรรม โดยทั่วไปกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ถูกใช้งานอยู่ในวงการวิทยาศาสตร์สำหรับสิงมีชีวิต, ชีววิทยา , วิทยาศาสตร์สำหรับสารกึ่งตัวนำ, และวัสดุศาสตร์

หลักการทำงานของกล้องคอนโฟคอล

หลักการพื้นฐานแก้ไข

ภาพหลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลที่ได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาวิน มินสกี้

หลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลนั้นได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาวิน มินสกี้ (Marvin Minsky) ^[2]^[3] การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลนี้มีจุดประสงค์เพื่อแก้ไขปัญหาข้อจำกัดต่างๆของกล้องจุลทรรศน์แสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบมุมมองกว้าง (wide-field fluorescence microscope) ซึ่งเป็นแบบดั้งเดิม โดยกล้องจุลทรรศน์แสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบมุมมองกว้างนั้นจะใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ความยาวคลื่นหนึ่งส่องไปบนทุกส่วนของชิ้นเนื้อตัวอย่าง และชิ้นเนื้อตัวอย่างนั้นจะสะท้อนแสงฟลูออเรสเซ็นอีกความยาวคลื่นหนึ่งมายังตัวรับแสง (photodetector) ดังนั้นตัวรับแสงจะรับแสงฟลูออเรสเซ็นที่สะท้อนมาทั้งหมด ซึ่งรวมถึงแสงที่ไม่ได้อยู่ที่จุดโฟกัส ในทางตรงกันข้ามกันกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลใช้แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซ็นแบบจุด (เกี่ยวข้องกับ Point Spread Function) และใช้เลนส์โฟกัสแสงไปบนชิ้นเนื้อตัวอย่างและรับแสงสะท้อนจากชิ้นเนื้อตัวอย่างมาผ่านรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงที่ไม่ได้อยู่บริเวณจุดโฟกัสก่อนที่แสงจะไปสู่ตัวรับแสง ดังนั้นจะมีแสงที่จุดโฟกัสเท่านั้นที่นำมาสร้างเป็นสัญญาณภาพ ด้วยเหตุนี้เองภาพที่ได้จึงมีความละเอียดสูงขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งความละเอียดของภาพทางด้านความลึก เนื่องจากแสงจากบริเวณที่ตื้นหรือลึกกว่าจุดโฟกัสจะถูกกำจัดโดยรูขนาดเล็กก่อนที่จะมาถึงตัวรับแสง แต่ถึงอย่างไรการใช้รูขนาดเล็กในการจำกัดแสงที่รับเข้ามาจะทำให้ภาพมีความเข้มของแสงลดลงตามไปด้วย ดังนั้นในการใช้กล้องคอนโฟคอลจึงจำเป็นต้องเพิ่มเวลาในการเปิดหน้ากล้องให้นานขึ้น เมื่อการรับแสงเป็นการรับแสงแบบทีละจุดจากจุดโฟกัส ดังนั้นการที่จะได้ภาพ 2 มิติ จำเป็นต้องทำการสแกนการรับภาพทางแนวราบทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่างชิ้นเนื้อแล้วนำมาประกอบกันเป็นภาพ 2 มิติที่สมบูรณ์ ในทำนองเดียวกันถ้าต้องการสร้างภาพ 3 มิติ จำเป็นต้องมีการสแกนการรับภาพทั้งทางแนวราบและแนวดิ่ง หลังจากนั้นนำข้อมูลมาสร้างเป็นภาพ 3 มิติ ที่สมบูรณ์ ความละเอียดทางด้านความลึกของจุดโฟกัสของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล หมายถึง ความหนาของบริเวณที่กล้องคอนโฟคอลยอมให้แสงผ่านเข้าไปยังตัวรับแสง ค่านี้ส่วนมากจะถูกกำหนดโดยผลลัพธ์ของความยาวคลื่นแสงหารด้วยค่าของรูรับแสงของเลนวัตถุ (Numerical Aperture, N.A.) ของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลยกกำลังสองและคุณสมบัติทางแสงของชิ้นเนื้อ จากที่กล่าวมาการจำกัดแสงสะท้อนทางด้านความลึกของชิ้นเนื้อทำให้เราสามารถสร้างภาพ 3 มิติ โดยการเลื่อนจุดโฟกัสไปยังตำแหน่งต่างๆทั้งทางด้านแนวราบและแนวดิ่งนั่นเอง

เทคนิคที่ใช้ในการสแกนในแนวราบของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแก้ไข

มีกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลอยู่ 3 ชนิดที่มีอยู่ในท้องตลาดปัจจุบัน

กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน (อังกฤษ: Confocal laser scanning microscpoes) กล้องชนิดนี้ใช้กระจก (โดยทั่วไป 2-3 ชิ้น) สแกนลำแสงเลเซอร์แบบเชิงเส้นทั้งในแกน x และแกน y ให้ทั่วทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่าง โดยที่รูขนาดเล็ก (pinhole) และตัวรับแสง (photodetector) ไม่เคลื่อนที่
กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) (อังกฤษ: Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscope) ใช้ชุดจานหมุนซึ่งมีรูขนาดเล็ก (pinhole) จำนวนมากในแผ่นจานในการสแกนลำแสงให้ทั่วทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่าง ในขณะที่แผ่นจานนั้นหมุน
กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้ (อังกฤษ: Programmable Array Microscopes ; PAM) เป็นการใช้สัญญาณอเล็คทรอนิคส์ควบคุมอุปกรณ์สำหรับปรับแต่งลำแสง (Spatial Light Modulator (SLM)) ซึ่งอุกรณ์นี้ทำหน้าที่เสมือนรูขนาดเล็กจำนวนมากที่สามารถเคลื่อนที่ได้ โดยอุปกรณ์ปรับแต่งลำแสงนี้ประกอบด้วยกระจกขนาดเล็กจำนวนมาก (microelectromechanical mirrors) ที่วางเรียงกันในรูปแบบตาราง โดยที่กระจกขนาดเล็กนี้สามารถปรับการหมุนและการสะท้อนด้วยสัญญาณทางไฟฟ้า กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดนี้ใช้ CCD เป็นตัวรับสัญญาณแสง

กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแต่ละชนิดมีข้อดีข้อเสียแตกต่างกันไป โดยที่ระบบของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลทุกชนิดพยายามปรับแต่งให้ระบบมีความเหมาะสมทั้งในด้านความเร็วในการบันทึกภาพและความละเอียดของภาพ โดยที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นสามารถปรับแต่งความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพ ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) และกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้มีความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพคงที่ แต่มีความเร็วในการเก็บสัญญาณภาพสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน ขณะนี้ในท้องตลาดนั้นกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) สามารถเก็บภาพด้วยความเร็วมากกว่า 50 ภาพต่อวินาที^[4] ซึ่งความเร็วดังกล่าวเป็นที่ต้องการเมื่อต้องการจับภาพความเคลื่อนไหวของเซลล์สิ่งมีชีวิตขณะมีชีวิตอยู่

การพัฒนาที่สำคัญที่เป็นจุดเปลี่ยนที่สำคัญของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนที่ทำให้ความเร็วในการเก็บภาพสูงขึ้นได้มากกว่ามาตรฐานวีดีโอ (60 ภาพต่อวินาที) โดยการนำเอากระจกขนาดเล็กมาใช้ในการสแกนลำแสงเลเซอร์ซึ่งกระจกขนาดเล็กนี้เป็นผลของการพัฒนาของระบบไฟฟ้าเครื่องกลจุลภาค (อังกฤษ: Microelectromechanical Systems ; MEMS)

การเอ็กซ์เรย์โดยใช้เทคนิคและหลักการเดียวกันกับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลโดยใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ เป็นเทคนิคใหม่ที่สามารถควบคุมความลึกของการเอ็กเรย์ได้ ตัวอย่างการใช้งานของการเอ็กเรย์ด้วยเทคนิคใหม่นี้คือการหาชั้นของพื้นผิวที่ถูกเขียนทับ ภายใต้ภาพเขียน^[5]

ภาพที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแก้ไข

β-tubulin ใน Tetrahymena
พื้นผิวของเหรียญ 1 ยูโร ที่ได้จาก กล้องคอนโฟคอล (จานนิพโค)
ข้อมูลที่ได้จากกล้องคอนโฟคอลของเหรียญ 1 ยูโร
ภาพตัดขวางของรูปก่อนหน้านี้ตรงพิกัด y=200

อ้างอิงแก้ไข

↑ Pawley JB (editor) (2006). Handbook of Biological Confocal Microscopy (3rd ed.). Berlin: Springer. ISBN 0-387-25921-X.
↑ Filed in 1957 and granted 1961. US 3013467
↑ Memoir on Inventing the Confocal Scanning Microscope, Scanning 10 (1988), pp128–138.
↑ "Data Sheet of NanoFocus μsurf spinning disk confocal white light microscope" (pdf).
↑ Vincze L (2005) "Confocal X-ray Fluorescence Imaging and XRF Tomography for Three Dimensional Trace Element Microanalysis". Microscopy and Microanalysis 11 (Supplement 2). doi:10.1017/S1431927605503167.

แหล่งข้อมูลอื่นแก้ไข

Molecular Expressions: Laser Scanning Confocal Microscopy
Emory’s Physics Department. Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
The Science Creative Quarterly's overview of confocal microscopy - high res images also available.
Programmable Array Microscope - Confocal Microscope Capabilities.
Introduction to Confocal Microscopy (video) เก็บถาวร 2013-07-18 ที่ เวย์แบ็กแมชชีน by Kurt Thorn (UCSF)

[1] Pawley JB (editor) (2006). Handbook of Biological Confocal Microscopy (3rd ed.). Berlin: Springer. ISBN 0-387-25921-X.

[2] Filed in 1957 and granted 1961. US 3013467

[3] Memoir on Inventing the Confocal Scanning Microscope, Scanning 10 (1988), pp128–138.

[4] "Data Sheet of NanoFocus μsurf spinning disk confocal white light microscope" (pdf).

[5] Vincze L (2005) "Confocal X-ray Fluorescence Imaging and XRF Tomography for Three Dimensional Trace Element Microanalysis". Microscopy and Microanalysis 11 (Supplement 2). doi:10.1017/S1431927605503167.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]